Molecular Evaluation of t(14;18)(bcl-2/IgH) Translocation in Follicular Lymphoma at Diagnosis Using Paraffin-Embedded Tissue SectionsNur Selvi1, Buket Kosova1, Mine Hekimgil3, Cumhur Gündüz1, Burçin Tezcanlı Kaymaz1, Emin Karaca4, Güray Saydam2, Murat Tombuloğlu2, Filiz Büyükkeçeci2, Seçkin Çağırgan2, Yeşim Ertan3, Nejat Topçuoğlu11Ege University, School Of Medicine, Medical Biology Department, İzmir, Turkey
2Ege University, School Of Medicine, Hematology Department, İzmir, Turkey
3Ege University, School Of Medicine, Pathology Department, İzmir, Turkey
4Ege University, School Of Medicine, Medical Genetics Department, İzmir, Turkey
OBJECTIVE: Follicular lymphoma (FL) is one of the most common lymphomas, and is characterized by t(14;18) (q32;q21) in more than 80% of patients. The aim of this study was to determine the rate of t(14;18) positivity based on the detection of mbr or mcr in paraffin-embedded tissue samples.
METHODS: The study included 32 paraffin-embedded tissue samples collected from 32 consecutive FL patients that were diagnosed and followed-up at our hospital between 1999 and 2006. The MBR breakpoint was identified based on real-time PCR using a LightCycler v.2.0 t(14;18) Quantification Kit (MBR), multiplex PCR, and seminested PCR. To identify the mcr breakpoint, real-time PCR was performed using specific primers and the FastStart DNA Master SYBR Green I Kit. To detect t(14;18) via fluorescence in situ hybridization (FISH) nuclei from paraffin-embedded tissue sections were extracted and used together with LSI IgH (immunoglobulin heavy chain) (spectrum green)/bcl-2 (B-cell leukemia-lymphoma 2) (spectrum orange) probes.
RESULTS: The DNA and nuclei isolation success rate for B5 formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections (n = 12) was 42% and 33%, respectively, versus 95% and 60%, respectively, for 20 tissue sections fixed in formalin only. In all, 24 paraffin-embedded tissue sections were analyzed and mbr positivity was observed in the DNA of 82.14% via seminested PCR, in 53.57% via multiplex PCR, and in 28.57% via real-time PCR. We did not detect mcr rearrangement in any of the samples. In all, 15 of 16 patients (93.75%) whose nuclei were successfully isolated were observed to be t(14;18) positive via the FISH method.
CONCLUSION: Semi-nested PCR and FISH facilitated the genetic characterization of FL tumors. As such, FISH and PCR complement each other and are both essential for detecting t(14;18) translocation.
Keywords: Follicular lymphoma, FISH, Multiplex PCR, Semi-nested PCR
Foliküler Lenfoma Tanısında Parafine-Gömülü Dokular Kullanılarak t(14;18)(bcl-2/IgH) Translokasyonun Moleküler Yöntemler ile DeğerlendirilmesiNur Selvi1, Buket Kosova1, Mine Hekimgil3, Cumhur Gündüz1, Burçin Tezcanlı Kaymaz1, Emin Karaca4, Güray Saydam2, Murat Tombuloğlu2, Filiz Büyükkeçeci2, Seçkin Çağırgan2, Yeşim Ertan3, Nejat Topçuoğlu11Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı
2Ege Üniveristesi, Tıp Fakültesi, Hematoloji Bilim Dalı
3Ege Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Patoloji Anabilim Dalı
4Ege Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Tıbbi Genetik Anabilim Dalı
AMAÇ: Foliküler lenfoma, lenfomalarda sıklıkla görülür ve hastaların %80 inden fazlası t(14;18) (q32;q21) translokasyonu ile karekterizedir. Bu çalışmada; 32 adet parafine gömülü doku örneğinde t(14;18) translokasyonunun tespiti için MBR ve mcr pozitifliği değerlendirildi.
YÖNTEMLER: MBR kırılma noktası LightCycler t(14;18) Quantification Kit (MBR) ile gerçek zamanlı PCR, multiplex PCR, and semi-nested PCR yöntemleri kullanılarak araştırıldı. mcr kırılma bölgesi spesifik primerler kullanılarak; Fast Start DNA Master SYBR Green I kiti kullanılarak gerçek-zamanlı bir cihazı olan LightCycler' da değerlendirildi. t(14;18) (q32;q21) translokasyonunun floresans in situ hibridizasyon (FISH) yöntemi ile tespit edilebilmesi için; parafine-gömülü doku örneklerinden nükleus izolasyonu yapıldı ve örnekler IgH/bcl-2 dual color,dual fusion translokasyon probu ile inkübe edildi.
BULGULAR: B5- Formalin ile fikse edilen parafine-gömülü 12 adet doku örneğinde DNA ve nükleus izolasyonununda sırasıyla % 42 ve % 33 başarı elde edilirken, formalinle fikse edilen 20 adet doku örneğinde bu başarı sırasıyla % 95 ve % 60 e kadar yükselmiştir. DNA izolasyonu başarılı olan 24 adet parafine-gömülü doku örneğinde; MBR pozitifliği % 82.14 başarı gösterirken, multipleks PCR sonuçlarına göre başarı oranı % 53.57 ve gerçek-zamanlı PCR ile % 28.57 olarak bulunmuştur.MBR negatif örneklerde mcr yeniden düzenlenmesi çalışılmış pozitif sonuç elde edilmemiştir. Nukleus izolasyonu başarılı olan 16 örneğin 15 inde (% 93.75) t(14;18) (q32;21) translokasyonu FISH yöntemi ile pozitif olarak bulunmuştur.
SONUÇ: Sonuç olarak semi nested PCR ve FISH yöntemleri tümörün genetik karekterizasyonunun aydınlatılması için kullanılabilecek iki fonksiyonel moleküler metoddur. Bu nedenle FISH ve PCR yöntemlerinin birbirini tamamladığı ve t(14;18) translokasyonunun tespitinde oldukça önemli birer parametre olduğu düşünülmektedir.
Anahtar Kelimeler: Foliküler lenfoma, FISH, Multiplex PCR, Semi-nested PCR
Nur Selvi, Buket Kosova, Mine Hekimgil, Cumhur Gündüz, Burçin Tezcanlı Kaymaz, Emin Karaca, Güray Saydam, Murat Tombuloğlu, Filiz Büyükkeçeci, Seçkin Çağırgan, Yeşim Ertan, Nejat Topçuoğlu. Molecular Evaluation of t(14;18)(bcl-2/IgH) Translocation in Follicular Lymphoma at Diagnosis Using Paraffin-Embedded Tissue Sections. Turk J Hematol. 2012; 29(2): 126-134
Corresponding Author: Nur Selvi, Türkiye |
|