In Vitro FVIII-Encoding Transgenic Mesenchymal Stem Cells Maintain Successful Coagulation in FVIII-Deficient Plasma Mimicking Hemophilia ACansu Hemşinlioğlu1, Elif Sibel Aslan2, Cihan Tastan3, Didem Çakırsoy4, Raife Dilek Turan5, Utku Seyis6, Muhammer Elek7, Gözde Sır Karakuş6, Ömur Selin Günaydın6, Selen Abanuz8, Derya Dilek Kançağı6, Bulut Yurtsever6, Koray Yalçın9, Murat Kasap10, Ercüment Ovalı61Acıbadem Labcell Cellular Therapy Laboratory, İstanbul, Türkiye; Molecular Biology and Medical Genetics Department, Biruni University, İstanbul, Türkiye
2Molecular Biology and Medical Genetics Department, Biruni University, İstanbul,
3Acıbadem Labcell Cellular Therapy Laboratory, İstanbul, Türkiye; Molecular Biology and Genetics Department, Üsküdar University, İstanbul, Türkiye; Transgenic Cell Technologies and Epigenetic Application and Research Center (TRGENMER), Uskudar University, İstanbul, Türkiye
4Acıbadem Labcell Cellular Therapy Laboratory, İstanbul, Türkiye; Medicine Department, Institute of Karolinska, Stockholm, Sweden
5Acıbadem Labcell Cellular Therapy Laboratory, İstanbul, Türkiye; Biotechnology Department, Yeditepe University, İstanbul, Türkiye; Cell and Gene Therapy Center of Excellence, Yeditepe University, İstanbul, Türkiye
6Acıbadem Labcell Cellular Therapy Laboratory, İstanbul, Türkiye
7Acıbadem Labcell Cellular Therapy Laboratory, İstanbul, Türkiye; Biotechnology Department, Yeditepe University, İstanbul, Türkiye
8Acıbadem Labcell Cellular Therapy Laboratory, İstanbul, Türkiye; Medical Biochemistry Department, Acibadem Mehmet Ali Aydinlar University, İstanbul, Türkiye
9Acıbadem Labcell Cellular Therapy Laboratory, İstanbul, Türkiye; Medical Park Goztepe Hospital, Pediatric Bone Marrow Transplantation Unit, İstanbul, Türkiye; Medical Biotechnology Department, Acıbadem Mehmet Ali Aydinlar University, İstanbul, Türkiye
10Department of Medical Biology, Medical School of Kocaeli University, Kocaeli, Türkiye
Objective: Hemophilia A is an X-linked recessive bleeding disorder caused by a deficiency of plasma coagulation factor VIII (FVIII), and it accounts for about 80%-85% of all cases of hemophilia. Plasma-derived therapies or recombinant FVIII concentrates are used to prevent and treat the bleeding symptoms along with FVIIImimicking antibodies. Recently, the European Medicines Agency granted conditional marketing approval for the first gene therapy for hemophilia A. The aim of this study was to determine the effectiveness of coagulation in correcting FVIII deficiency with FVIII-secreting transgenic mesenchymal stem cells (MSCs).
Materials and Methods: A lentiviral vector encoding a B domaindeleted FVIII cDNA sequence with CD45R0 truncated (CD45R0t) surface marker was designed to develop a transgenic FVIII-expressing primary cell line by transducing MSCs. The efficacy and functionality of the FVIII secreted from the MSCs was assessed with anti-FVIII ELISA, CD45R0t flow cytometry, FVIII western blot, and mixing test analysis in vitro.
Results: The findings of this study showed that the transgenic MSCs maintained persistent FVIII secretion. There was no significant difference in FVIII secretion over time, suggesting stable FVIII expression from the MSCs. The functionality of the FVIII protein secreted in the MSC supernatant was demonstrated by applying a mixing test in coagulation analysis. In the mixing test analysis, FVIIIdeficient human plasma products were mixed with either a saline control or FVIII-secreted MSC supernatant. The mean FVIII level of the saline control group was 0.41±0.03 IU/dL, whereas the mean level was 25.41±33.38 IU/dL in the FVIII-secreting MSC supernatant mixed group (p<0.01). The mean activated partial thromboplastin time (aPTT) of the saline control group was 92.69±11.38 s, while in the FVIII-secreting MSC supernatant mixed group, the mean aPTT level decreased to 38.60±13.38 s (p<0.001).
Conclusion: The findings of this in vitro study suggest that the new method presented here is promising as a possible treatment for hemophilia A. Accordingly, a study of FVIII-secreting transgenic MSCs will next be initiated in a FVIII-knockout animal model.
Keywords: Factor VIII, Gene therapy, Hemophilia A, Lentivirus, Mesenchymal stem cells
İn Vitro FVIII İçeren Transgenik Mezenkimal Kök Hücreler Hemofili A’yı Taklit Eden FVIII İçermeyen Plazmada Başarılı Koagülasyon SağlamaktadırCansu Hemşinlioğlu1, Elif Sibel Aslan2, Cihan Tastan3, Didem Çakırsoy4, Raife Dilek Turan5, Utku Seyis6, Muhammer Elek7, Gözde Sır Karakuş6, Ömur Selin Günaydın6, Selen Abanuz8, Derya Dilek Kançağı6, Bulut Yurtsever6, Koray Yalçın9, Murat Kasap10, Ercüment Ovalı61Acıbadem Labcell Cellular Therapy Laboratory, İstanbul, Türkiye; Molecular Biology and Medical Genetics Department, Biruni University, İstanbul, Türkiye
2Molecular Biology and Medical Genetics Department, Biruni University, İstanbul,
3Acıbadem Labcell Cellular Therapy Laboratory, İstanbul, Türkiye; Molecular Biology and Genetics Department, Üsküdar University, İstanbul, Türkiye; Transgenic Cell Technologies and Epigenetic Application and Research Center (TRGENMER), Uskudar University, İstanbul, Türkiye
4Acıbadem Labcell Cellular Therapy Laboratory, İstanbul, Türkiye; Medicine Department, Institute of Karolinska, Stockholm, Sweden
5Acıbadem Labcell Cellular Therapy Laboratory, İstanbul, Türkiye; Biotechnology Department, Yeditepe University, İstanbul, Türkiye; Cell and Gene Therapy Center of Excellence, Yeditepe University, İstanbul, Türkiye
6Acıbadem Labcell Cellular Therapy Laboratory, İstanbul, Türkiye
7Acıbadem Labcell Cellular Therapy Laboratory, İstanbul, Türkiye; Biotechnology Department, Yeditepe University, İstanbul, Türkiye
8Acıbadem Labcell Cellular Therapy Laboratory, İstanbul, Türkiye; Medical Biochemistry Department, Acibadem Mehmet Ali Aydinlar University, İstanbul, Türkiye
9Acıbadem Labcell Cellular Therapy Laboratory, İstanbul, Türkiye; Medical Park Goztepe Hospital, Pediatric Bone Marrow Transplantation Unit, İstanbul, Türkiye; Medical Biotechnology Department, Acıbadem Mehmet Ali Aydinlar University, İstanbul, Türkiye
10Department of Medical Biology, Medical School of Kocaeli University, Kocaeli, Türkiye
Amaç: Hemofili A, pıhtılaşma faktörü VIII’in (FVIII) eksikliğine bağlı gelişen, hemofili hastalarının yaklaşık %80-85’ini oluşturan, X’e bağlı resesif geçiş gösteren bir kanama bozukluğudur. Kanama semptomlarını önlemek ve tedavi etmek için plazma kaynaklı tedaviler ya da rekombinant FVIII konsantreleri ile FVIII’i taklit eden monoklonal antikorlar kullanılmaktadır. Son zamanlarda EMA, hemofili A’nın ilk gen tedavisi için koşullu pazarlama onayı vermiştir. Bu çalışmada, hemofili A hastalığından sorumlu olan FVIII eksikliğini düzeltebilmek amacıyla FVIII salgılayan transgenik mezenkimal kök hücreler (MKH) ile koagülasyon etkinliğinin değerlendirilmesi amaçlanmaktadır.
Gereç ve Yöntem: CD45R0 truncated (CD45R0t) yüzey belirteci ile B domaini silinmiş FVIII cDNA dizisini kodlayan bir lentiviral vektör, MKH’leri transdükte ederek transgenik FVIII ekspresyonu sağlayan birincil bir hücre hattı geliştirilmiştir. MKH’lerden salgılanan FVIII proteininin etkinliği ve fonksiyonalitesi anti-FVIII ELISA, CD45R0t akım sitometrisi, FVIII western blot ve karışım testi (mixing test) analizleri ile in vitro olarak değerlendirilmiştir.
Bulgular: Çalışmamızda transgenik MKH’lerin kalıcı FVIII sekresyonu sağladığı gösterilmiştir. Zamana bağlı yapılan analizlerde FVIII sekresyonunda anlamlı bir değişim olmadığı, MKH’lerde stabil FVIII ekspresyonu sağladığı gösterilmiştir. Koagülasyon analizlerinde, MKH süpernatanına sekrete olan FVIII proteininin fonksiyonalitesi, karışım testi kullanılarak saptanmıştır. Karışım testi analizlerinde, FVIII içermeyen insan plazma ürünleri salinle (kontrol grubu) ve FVIII-salgılayan MKH süpernatantı (çalışma grubu) ile karıştırılmıştır. Kontrol grubunun ortalama FVIII düzeylerinin 0,41±0,03 IU/dL olduğu, MKH süpernatant ile karıştırılan çalışma grubunda ise ortalama FVIII düzeylerinin 25,41±33,38 IU/ dL (p<0,01) olduğu gösterilmiştir. Kontrol grubunun ortalama aktive parsiyel tromboplastin zamanı (aPTT) 92,69±11,38 saniye iken, FVIIIsalgılayan MKH süpernatantı ile karıştırılan grubun ise ortalama aPTT seviyelerinin 38,60±13,38 saniyeye düştüğü gösterilmiştir (p<0,001).
Sonuç: Bu in vitro çalışma, hemofili A’yı tedavi etmek için uygulanabilir umut verici yeni bir yöntem ortaya koymaktadır. Bu veriler ışığında FVIII knock-out hayvan modelinde FVIII salgılayan transgenik MKH çalışması başlatılacaktır.
Anahtar Kelimeler: Faktör VIII, Gen tedavisi, Hemofili A, Lentivirüs, Mezenkimal kök hücre
Cansu Hemşinlioğlu, Elif Sibel Aslan, Cihan Tastan, Didem Çakırsoy, Raife Dilek Turan, Utku Seyis, Muhammer Elek, Gözde Sır Karakuş, Ömur Selin Günaydın, Selen Abanuz, Derya Dilek Kançağı, Bulut Yurtsever, Koray Yalçın, Murat Kasap, Ercüment Ovalı. In Vitro FVIII-Encoding Transgenic Mesenchymal Stem Cells Maintain Successful Coagulation in FVIII-Deficient Plasma Mimicking Hemophilia A. Turk J Hematol. 2023; 40(2): 118-124
Corresponding Author: Cansu Hemşinlioğlu |
|