Cardiogenic and Myogenic Gene Expression in Mesenchymal Stem Cells After 5-Azacytidine TreatmentAungkura Supokawej1, Pakpoom Kheolamai2, Kuneerat Nartprayut1, Yaowalak U-pratya3, Sirikul Manochantr2, Methichit Chayosumrit4, Surapol Issaragrisil31Mahidol University, Faculty Of Medical Technology, Department Of Clinical Microscopy, Bangkok, Thailand
2Thammasat University, Faculty Of Medicine, Division Of Cell Biology, Department Of Pre-clinical Science, Pathumthani, Thailand
3Mahidol University, Faculty Of Medicine, Division Of Hematology, Department Of Medicine, Siriraj Hospital, Bangkok, Thailand
4Mahidol University, Faculty Of Medicine, Siriraj Hospital, Siriraj Center Of Excellence For Stem Cell Research, Bangkok, Thailand
OBJECTIVE: 5-Azacytidine is a hypomethylating agent that is used for the treatment of myelodysplastic syndrome. This histone modifier is widely employed and plays a nonspecific role in influencing the differentiation capability of stem cells. The ability of bone marrow mesenchymal stem cells to differentiate into cardiomyocyte- and myocyte-like cells after exposure to 3 different doses of 5-azacytidine has been evaluated and compared. The aim of the study was to optimize the effective dose of 5-azacytidine for promoting the cardiomyocyte and myocyte differentiation capabilities of human mesenchymal stem cells (MSCs).
METHODS: Human bone marrow aspirations were collected from healthy donors. MSCs were used for the study of mesodermal differentiation. MSCs were cultured to promote osteoblast differentiation and adipocyte differentiation. The evaluation of osteogenic or adipogenic properties was then performed through immunocytochemical staining. BMMSCs were trypsinized into single-cell suspensions and then prepared for flow cytometric analysis. The MSCs were treated with 5, 10, or 15 μM 5-azacytidine for 24 h and then cultured for 3 weeks. Total RNA was extracted from untreated and 5-azacytidine–treated cells. Troponin T and GATA4 antibodies were used as cardiogenic markers, whereas myogenin and MyoD antibodies were used as myocyte markers.
RESULTS: The morphology and growth rate of MSCs that were treated with any of the 3 doses of 5-azacytidine were similar to the morphology and growth rate of control MSCs. An immunofl uorescence analysis examining the expression of the cardiac-specifi c markers GATA4 and troponin T and the skeletal muscle-specifi c markers MyoD and myogenin revealed that cells treated with 15 μM 5-azacytidine were strongly positive for these markers. Real-time RT-PCR results were examined; these amplifi cations indicated that there were higher expression levels of cardiac- and skeletal muscle-specifi c mRNAs in MSCs treated with 15 μm 5-azacytidine than in MSCs that had either been treated with lower doses of 5-azacytidine or left untreated.
CONCLUSION: MSCs treated with 5-azacytidine demonstrated the capacity to differentiate into both cardiomyocytes and skeletal myocytes, and 15 μM 5-azacytidine could be the optimal dose of this drug. Other promoting factors should be examined to investigate the possibility of promoting the differentiation of MSCs into specific cell types.
Keywords: Mesenchymal stem cells, Differentiation, Cardiomyocyte, Myocyte
5-Azasitidin Tedavisi Sonrasında Mezenkimal Kök Hücrelerinde Kardiyojenik ve Miyojenik Gen SunumuAungkura Supokawej1, Pakpoom Kheolamai2, Kuneerat Nartprayut1, Yaowalak U-pratya3, Sirikul Manochantr2, Methichit Chayosumrit4, Surapol Issaragrisil31Mahidol Üniversitesi, Tıbbi Teknoloji Fakültesi, Klinik Mikroskopi Bölümü, Bangkok, Tayland
2Thammasat Üniversitesi Tıp Fakültesi, Hücre Biyolojisi Bölümü, Ön Klinik Bilimi Bölümü, Pathumthani, Tayland
3Mahidol Üniversitesi Tıp Fakültesi, Hematoloji Bölümü, Siriraj Hastanesi, Tıp Bölümü, Bangkok, Tayland
4Mahidol Üniversitesi Tıp Fakültesi, Siriraj Hastanesi, Kök Hücre Araştırma Mükemmellik Siriraj Merkezi, Bangkok, Tayland
AMAÇ: 5-Azasitidin miyelodisplastik sendrom tedavisinde kullanılan hipometile edici bir ajandır. Bu histon değiştiricisi, kök hücrelerin diferansiyasyon yeteneği üzerinde yaygın olarak etkilidir ve bu konuda seçici olmayan bir rol oynamaktadır. Üç farklı dozda 5-azasitidine maruz kaldıktan sonra, kemik iliği mezenkimal kök hücrelerinin kardiyomiyosit ve miyosit benzeri hücrelere diferansiyasyon yeteneği irdelendi ve karşılaştırıldı. Bu çalışmanın amacı, 5-azasitidinin insan mezenkimal kök hücrelerinin (MKH) kardiyomiyosit ve miyosite diferansiyasyonunu sağlamak için gerekli olan etkin dozunun tespit edilmesidir.
YÖNTEMLER: İnsan kemik iliği aspirasyonları sağlıklı donörlerden yapıldı. MSCler osteoblast ve adipozit farklılaşması için kültüre edildi. Osteojenik veya adipojenik özellikler immunositokimyasal boyama ile incelendi. BMMSCler tripsinize edilerek tek hücre süspansiyonu elde edildi ve akım sitometri için hazırlandı. MSClere 5, 10 veya 15 μM 5-azacytidine 24 saat uygulandı, daha sonra 3 hafta kültüre edildi. Total RNA 5-azacytidine uygulanan ve uygulanmayan hücrelerden elde edildi. Troponin T ve GATA4 antikorları kardiyojenik belirteçler, myojenin ve MyoD antikorları myosit belirteçleri olarak kullanıldı.
BULGULAR: 5-Azasitidinin her 3 dozuna da maruz kalmış MKH’lerin morfoloji ve büyüme hızları, kontrol MKH’lerin morfoloji ve büyüme hızları ile benzerdi. İmmünfloresans yöntemi ile kalbe özgül belirteçler olan GATA4 ve troponin T ile çizgili kasa özgül belirteçler olan MyoD ve miyojenin sunumlarının incelenmesi sonucunda, 15 μM 5-azasitidine maruz kalan hücrelerde bu belirteçlerin kuvvetli pozitif olduğu görüldü. Gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu sonuçları incelendi; 15 μM 5-azasitidine maruz kalan MKH’lerde, daha düşük doz 5-azasitidin alan veya 5-azasitidin uygulanmayan MKH’lere göre kalp ve çizgili kasa özgül mRNA’ların daha yüksek oranda sunum düzeyleri olduğu tespit edildi.
SONUÇ: 5-Azasitidine maruz bırakılan MKH’lerin kardiyomiyosit ve miyositlere diferansiye olma yeteneği olduğu ve en uygun dozun 15 μM 5-azasitidin olabileceği gösterildi. MKH’lerin özgül hücre tiplerine diferansiyasyonunu incelemek için bunu etkileyebilecek diğer faktörlerin de irdelenmesi gerekmektedir.
Anahtar Kelimeler: Mezenkimal kök hücreler, Diferansiyasyon, Kardiyomiyosit, Miyosit
Aungkura Supokawej, Pakpoom Kheolamai, Kuneerat Nartprayut, Yaowalak U-pratya, Sirikul Manochantr, Methichit Chayosumrit, Surapol Issaragrisil. Cardiogenic and Myogenic Gene Expression in Mesenchymal Stem Cells After 5-Azacytidine Treatment. Turk J Hematol. 2013; 30(2): 115-121
Corresponding Author: Aungkura Supokawej, Thailand |
|