Transcriptomic Characterization of TCR-NK Cells Reveals Challenges Associated with CD3ζ Overexpression

Objective: TCR-engineered NK cells represent a promising strategy for targeting intracellular tumor antigens while overcoming the risk of TCR alpha/beta chain mispairing inherent to TCR-engineered T cells. Previous work showed that CD3ζ overexpression in TCR-NK cells did not improve antigen-specific cytotoxicity and instead increased non-specific background reactivity. This study aims to investigate the molecular alterations associated with this phenotype by examining the transcriptomic profile of engineered NK-92 cells.
Materials and Methods: Wild-type and genetically modified NK-92 cell lines expressing a tyrosinase-specific TCR in the presence or absence of CD3ζ overexpression were analyzed. Bulk RNA sequencing was followed by differential gene-expression analysis, hierarchical clustering, multidimensional scaling, and pathway enrichment analysis. CD28 surface expression was assessed by flow cytometry, and activation-associated signaling responses were evaluated by western blotting after CD3/CD28 stimulation.
Results: CD3ζ-overexpressing NK-92 cells formed distinct transcriptomic clusters and displayed broader gene expression changes. Expression of CD3δγε alone or in combination with tyrosinase-specific TCR resulted in comparatively limited transcriptional divergence from the empty-vector control, whereas CD3ζ inclusion shifted enriched pathways toward lymphocyte activation, cytotoxicity, and PI3K–AKT-related signaling. CD3ζ- overexpressing cells also exhibited increased CD28 surface expression and altered phosphorylation patterns, most notably involving AKT in response to CD3/CD28 stimulation.
Conclusion: CD3ζ overexpression is not a neutral modification in TCR-NK cell engineering. It is associated with broad transcriptional remodeling and activation-associated signaling changes that may provide a molecular context for the previously observed increase in non-specific activity. These findings support TCR-NK engineering strategies that preserve endogenous CD3ζ regulation while introducing only the missing CD3δγε components required for functional TCR expression.

Keywords: TCR-NK cells, natural killer cells, CD3ζ,, T cell receptor, transcriptomics, RNA sequencing

TCR-NK Hücrelerinin Transkriptomik Karakterizasyonu, CD3ζ Yüksek İfadesi ile İlişkili Zorlukları Tespit Etmektedir

Amaç: TCR ile modifiye edilmiş NK hücreleri, aynı yöntemin uygulandığı T hücrelerinde görülebilen yanlış TCR zincir eşleşmesi riskinden kaçınırken, hücre içi tümör antijenlerinin hedeflenmesi için umut vadeden bir strateji sunmaktadır. Önceki çalışmalar, TCR-NK hücrelerinde ekzojen CD3ζ ifadesinin antijen-spesifik aktiviteyi artırmadığını; bunun yerine arka plan reaktivitesini yükselttiğini göstermiştir. Bu çalışmada, genetik olarak modifiye edilmiş NK-92 hücrelerinin transkriptomik profili incelenerek bu fenotiple ilişkili moleküler değişikliklerin araştırılması amaçlanmıştır.
Gereç ve Yöntemler: CD3ζ yüksek ifadesi bulunan veya bulunmayan, tirozinaz-spesifik TCR ifade eden vahşitip ve modifiye edilmiş NK-92 hücre hatları analiz edilmiştir. Bulk RNA dizileme sonrası diferansiyel gen ifade analizi, hiyerarşik kümeleme, çok boyutlu ölçekleme ve yolak zenginleştirme analizleri yapılmıştır. CD28 yüzey ifadesi akan hücre ölçer ile değerlendirilmiş, aktivasyonla ilişkili sinyal yanıtları ise CD3/CD28 uyarımı sonrasında Western blot ile incelenmiştir.
Bulgular: CD3ζ yüksek ifade eden NK-92 hücreleri belirgin transkriptomik kümeler oluşturmuş ve CD3ζ-negatif gruplara kıyasla daha fazla gen ifadesi değişiklikleri göstermiştir. Tirozinaz-spesifik TCR ile birlikte veya tek başına CD3δγε ekspresyonu, boş vektör kontrolüne kıyasla sınırlı düzeyde transkripsiyonel farklılaşmaya yol açarken, CD3ζ’nin eklenmesi, lenfosit aktivasyonu, sitotoksisite ve PI3K–AKT ilişkili sinyal yolaklarında değişikliklere yol açmıştır. CD3ζ yüksek ifade eden hücrelerde ayrıca CD28 yüzey ifadesinin arttığı ve CD3/CD28 uyarımı sonrasında özellikle AKT ilişkili sinyal paternlerinin değiştiği gözlenmiştir.
Sonuç: CD3ζ aşırı ifadesi, TCR-NK hücre mühendisliğinde nötr bir modifikasyon değildir. Bu durum, geniş çaplı transkripsiyonel yeniden yapılanma ve aktivasyona yönelik sinyal değişiklikleri ile ilişkili olup, bu değişiklikler daha önce gözlenen non-spesifik aktivite artışına moleküler bir bağlam sağlayabilir. Bu bulgular, fonksiyonel TCR ifadesi için gerekli olan CD3δγε bileşenlerini eklerken endojen CD3ζ ifadesiyle yetinen TCRNK tasarımlarını ön plana çıkartmaktadır.

Anahtar Kelimeler: TCR-NK hücreleri, doğal öldürücü hücreler, CD3ζ,, T hücresi reseptörü, transkriptomik, RNA dizileme